Antimicrobial activities of Aloe barbadensis Miller leaves and their effects on lactic acid bacteria behavior

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Volume 64, Article 02

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Activités antimicrobiennes des feuilles de l’Aloe barbadensis Miller et leurs effets sur le comportement des bactéries lactiques

O. BEN MOUSSA ¹*

I. MAHOUACHI ¹

I. DAMMAK ¹

M. BOULARES ¹

I. MAHMOUDI ¹

M. HASSOUNA ¹

¹Unité de recherche ‘Bio-conservation et valorisation des Produits Agro-alimentaires UR13AGR02 – Ecole Supérieure des Industries Alimentaires de Tunis-Université de Carthage-

Abstract – In the present study, antibacterial activity of Aloe vera gel or peel extracts were tested against commons foodborne pathogens. Ethanolicpeel extract and raw gel were the most effective, againstStaphylococcus aureus. Howerver, antifungal activity was obtained only for ethanolic extracts. Cell damage test affirms these findings. Furthermore, different concentrations of Aloe vera gel (0%, 5%, 15%, 25%, 50% and 100%) incorporated into the growth media of technological and probiotic lactic acid bacteria were tested to observe the effect on growth and activities of these bacteria. From the obtainedresults, it could be clearly advocated that lactic acid bacteria behavior depend on strains, and that 15% of Aloe vera gel could promote the growth and activities of mix starter (M2) and probiotic strain (S1).

Keywords: Aloe vera, antimicrobial activity, lactic acid bacteria

Resumé – Les activités antibactériennes de différents extraits du gel et de l’écorce de la feuille de l’Aloe barbadensis Miller, sont évaluées. Les pouvoirs inhibiteurs desextraits éthanoliquesde l’écore et du gel, contreStaphylococcus aureus, sont les plus élevés. Uniquement ces extraits éthanoliquesont révélé une activité antifongique vis-à-vis d’Aspergillus niger. Le comportement des bactéries lactiques technologiques et probiotiques en présence de différentes concentrations du gel (0%, 5%, 15%, 25%, 50% et 100%), a montré que la souche probiotique, L. fermentum (S1) et le ferment mixte M2, sont les cultures des bactéries lactiques dont la croissance et l’activité sont stimulées par le gel d’Aloe vera, particulièrement à la dose de 15%.

Mots clés: Aloe vera, activité antimicrobienne, bactéries lactiques

1. Introduction

La science nutritionnelle a évolué d’une approche préventive des déficiences alimentaires, vers la promotion du rôle de l’alimentation, dans le maintien de la santé, du bien êtreet/ou la réduction du risque de maladies. Ainsi, une nouvelle catégorie d’aliments a apparu, il s’agit des aliments fonctionnels, qui exercent un effet sur une fonction de l’organisme dans un sens favorable à la santé (Multon et al.2013). Pour répondre à cette nouvelle tendance, l'industrie alimentaire a fait appel à des ingrédients caractériséspar leurs capacités à exercer des effets positifs sur la santé du consommateur, tels que les probiotiques et les prébioiques (Cruz et al. 2013; Ben Moussa et al. 2019).Dans ce contexte, plusieurs plantes médicinales ou des préparations à base de plantes ont reçu une attention considérable, grâce à leurs effets bénéfiques sur la santé (Sofowora, 2010). Parmi toutes ces plantes médicinales utilisées, l’Aloe vera, est considérée comme la plante la plus puissante, en raison de ses propriétés thérapeutiques et fonctionnelles. En effet, des études ont montré qu’elle possède des activités anti-inflammatoires, antioxydantes, immunostimulantes, antidiabétiques, pour améliorer la digestion, pour soigner les ulcères et même le cancer (Alemdar et Agaoglu, 2009; Jasso et al.2005).

L’Aloe barbadensis Miller est considérée l’espèce la plus biologiquement active (Bozzi et al. 2007), grâce au gel extrait de la feuille. Ce dernier est doté de pouvoirsantimicrobiens (Anitha et al. 2016).En revanche, peu d’études ont traité l’écorce de la feuille de l’Aloe vera. Par ailleurs, l’extraction des composés actifs, en utilisant plusieurs solvants organiques, pourraient promouvoir les activités biologiques de l’Aloevera.

Dans cette même optique, les laits fermentés sont souvent reconnus en tant qu’aliments fonctionnels grâce à leurs richessesen bactéries lactiques industrielles ou probiotiques. Ils sont devenusune stratégie marketing pour les industries laitières qui les utilisent en tant que matrice permettant de véhiculer d’autres ingrédients fonctionnels.

Ainsi, le présent travail vise à (i) étudier les activités antimicrobiennes de différents extraits du gel de l’Aloe vera et de l’écorce; (ii) étudier le comportement de bactéries lactiques industrielles ou probiotiques en présence du gel de l’Aloevera.

2. Matériel et Méthodes

Les feuilles d’Aloe vera de l’espèce barbadensis Millers ont fournies par l’entreprise « Aloé méditerranée», sise àSousse. 

2.1. Extraction du gel d’Aloe veraet récupération des écorces

L’extraction du gel est réalisée selon la méthode décrite par Ramachandra et Rao (2008).Le gel blanchâtre et translucide obtenu est directement utilisé ou conservé au congélateur.Les écorces des feuilles sont récupérées et séchées à l’étuve à 80°C pendant deux jours (Arunkumar et Muthuselvan, 2009)

2.2. Préparation des extraits d’Aloe vera

Les solvants testés sont: le dichlorométhane, le chloroforme, l’eau distillée, l’éthanol et le méthanol. Les extraits sont obtenus à partir de 50g de gel ou de 10g d’écorce séchés selon le protocole décrit par Joshua et al.(2010).

2.3. Mesure de l’activité antimicrobienne

2.3.1. Méthode de diffusion

L'activité antimicrobienne des différents extraits est testée en utilisant la méthode de diffusion sur disque en papier filtre stérilisé (Valgas et al. 2007). Les souches indicatrices utilisées sont : Staphylococcus aureus (ATCC25923), Pseudo monas aeruginosa (P27853), Escherichia coli (4K12) et Aspergillus Niger (CERTE, Borj Cedria Tunisie).100µL de chaque culture jeune des souches indicatrices, sont inoculées dans la gélose nutritive, ensuite les disques sont placés. Ces derniers seront imbibés par chacun des extraits à raison de 100 µL. L’incubation est effectuée pendant 18h à 24h à. L’activité antimicrobienne est classée selon le diamètre des halos d’inhibition obtenus : pas d’activités (-) pour les diamètres moins de 8mm ; activité moyenne (+) pour les diamètres de 9 à 14mm ; très sensible (++) pour des diamètres de 15 à 19mm et extrêmement sensible (+++) pour les diamètres plus de 20mm (Ponce et al. 2003).

2.3.2. Estimation du dommage cellulaire

Une culture jeune de chacune des souches indicatrices, précédemment cités, est centrifugée à 10000 tours/min pendant 15 minutes à 4°C. Le culot est lavé deux fois avec un tampon phosphate (20 nM, pH 7). Pour vérifier la quantité des cellules endommagées causées par les extraits aqueux et éthanolique des écorces d’Aloe vera. 100 µL de la suspension bactérienne ont été incubées avec 100 µL d’extrait d’écorce d’Aloe vera. Le mélange est incubé à 37°C pendant 30 minutes, les absorbances à 260 nm et 280 nm avant et après incubation sont mesurées (Dua et al. 2013).

2.4. Mesure de l’effet de la teneur en gel d’Aloe vera sur les ferments lactiques technologiques et probiotiques

Les ferments lactiques utilisés sont : DSM YS 131 et YF 812 (Charles Hansen) destinés à la fabrication du yaourt (Lactobaccilus bulgaricus et Streptococcus thermophilus), BIF6 (DSM), une souche probiotique commerciale Bifidobactérium lactis, et deux souches de Lactobacillus fermentumprobiotiques, isolées à partir du lait camelin au sein de l’UR 13AGR02 (Mahmoudi et al. 2016). Chacune des cultures jeunes de bactérie lactique est inoculée à raison de 1% dans un volume total de 50 mL de bouillon MRS. Ce dernier est préparé avec le gel d’Aloe vera à raison de (0%, 5%, 15%, 25%, 50%, 100%). Enfin, les bouillons sont incubés à 37°C pendant 24h et 48h. Les mesures du pH, de l’acidité titrable (AOAC, 1990)et le dénombrement des bactéries lactiques (APHA, 2001) sont effectuées à 0h, 24h et 48h.

2.5. Analyses statistiques

Une analyse de la variance (ANOVA) a été réalisée à fin d’étudier les effets des différents extraits. Le logiciel utilisé estIBM SPSS Statistics version 2.0. Tous les seuils de significations ont été basés sur une probabilité de 5%. L’analysemultivariée en composantes principales (ACP) des bactéries lactiques inoculées en présence de différentes concentrations de gel, est réalisée en utilisant le logiciel XLstat version 2018.1.

3. Résultats et Discussion

3.1 Evaluation de l’activité antimicrobienne d’Aloe barbadensis Miller

3.1.1. Méthode de diffusion

Les diamètres des zones d’inhibitions diffèrent d’une souche bactérienne à une autre et d’un extrait à un autre (Figure 1, Tableau 1). Staphyloccus aureus est la souche la plus sensible aux différents extraits, suivie par Pseudomonas aeruginosa et Aspergillus niger. Enfin, l’inhibition d’E. coli n’est pas significative (diamètre du halot clair maximalest 7 mm ± 0.27). Ces résultats sont en accord avec les constations d’Agarry et al. (2005); et elles pourraient être dus à la composition membranaire des bactéries Gram négatifs. En effet, ces dernières possèdent une membrane qui présente une perméabilité sélective; la surface des lipopolysacharides contient des charges négatives, qui empêchent la diffusion des molécules hydrophobes, et des porines qui bloquent le passage des molécules à haut poids moléculaire (Garrett et Grisham, 2000; Nikaido, 2003). Par ailleurs, l’extrait éthanolique du gel possède l’activité antimicrobienne la plus intense (3+).Ces résultats vont de pair avec ceux de Thiruppathi et al. (2010) qui ont trouvé des pouvoirs inhibiteurs élevés en utilisant ce même type d’extrait. Ceci pourrait être expliqué par sa richesse enmolécules bioactives, il en contient 26 selon l’analyse GC-MS réalisée dans l’étude d’Arunkumar et Muthuselvan (2009). Concernant, l’activité antifongique contre Aspergillus niger, ellen’est perçue qu’en présence desextraits éthanoliquesdu gel ou de l’écorce.

Non sensible (-) pour les diamètres moins de 8mm ; Sensible (+) pour les diamètres de 8 à 14mm (Ponce et al., 2003).

3.1.2. Estimation du dommage cellulaire des souches indicatrices

L’estimation du dommage cellulaire a été évaluée en présence des extraits aqueux et éthanolique desécorces de l’Aloe vera (Tableau 2), en mesurant l’augmentation de la densité optique des suspensions microbiennes à 260 et 280 nm. ΔDO les plus élevés sont obtenus en présence de l’extrait éthanolique, particulièrement contre Staphylococcus aureus. Ces données affirment les constations obtenues par la méthode de diffusion précédemment discutées. En revanche, ΔDO des cultures d’E. coli suggère une activité antibactérienne des deux types d’extraits vis-à-vis de cette souche. Par ailleurs, l’augmentation des densités optiques obtenues à 280 nm sont supérieures à celles mesurées à 260 nm. Ce résultat induit une action bactériostatique des extraits des écorces sur cette souche (de même pour P. aeruginosa), puisque la DO à 280nm informe sur la concentration en protéines, et celle à 260 nm, sur la quantité d’acides nucléiques dans la suspension. Il est à noter que dans la majorité des situations les pouvoirs antibactériens de l’extrait éthanolique sont plus élevés que celui de l’extrait aqueux. Concernant, les dommages cellulaires obtenus pour Aspergillus niger, ilssont faibles, conformément aux résultats de la méthode de diffusion.

3.2. Etude de l’effet du gel de l’Aloe vera sur les bactéries lactiques

Les valeurs du pH (Tableau 3), des cultures jeunes des bactéries lactiquesdu yaourt ou probiotiquesincubées pendant 24 et 48h dans un bouillon MRS, enrichi par le gel de l’Aloe vera (à raison de 0, 5, 15, 25, 50 et 100%), diminuent considérablement au cours des premières 24h (ΔpH de 1,5 à 2 lorsque la dose d’Aloevera ajoutée varie de 0 à 50%.Cela est dû à la capacité des bactéries lactiques à diminuer le pH de l'environnement en produisant des acides organiques.Cependant, à l’exception de la souche de Bifidobacterium lactis, et en présence de la dose 100% d’Aloe vera, ΔpH est nettement plus faible (0,24 à 0,6). Ce même profil est observé pour les valeurs d’acidité. En revanche, après 48h d’incubation, les baisses du pH ne sont pas significative (P<0,05). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenues par Nagpal et al. (2012), qui ont montré que la variation du pH et de l’acidité du milieu enrichi par le gel d’Aloe vera et en présence de L. plantarum ou L. acidophilus, sont nettement plus importante après 24h qu’au bout de 48h. Ainsi, l’activité acidifiante des ferments mixtes ou en culture simple est maximale au cours des premières 24 h d’incubation.

Quant à la croissance bactérienne (Tableau 3), elle augmente considérablement au cours des premières 24h (0,3 à 1,4 unité log UFC/ml). Cependant, entre 24 et 48 h, la variation du nombre de colonies est faible, elle tend à la baisse pour les souches probiotiques L. fermentum (S1 et S2), contre une augmentation pour la souche (B) et les ferments industriels mixtes (M1 et M2), au niveau des doses de 5 à 25% de gel d’Aloe vera. En effet, le gel d’Aloe vera est riche en polysaccharides : cellulose, glucose, mannose, L-rhamniose, aldopentose ; ces hydrates de carbones sont utilisés par plusieurs souches de bactéries lactiques, tel que L.fermentum, L.acidophilus en tantque prébiotiques ; par contre, la croissance bactérienne d’autres souches comme L. helveticus pourrait être inhibée dans les mêmes conditions (Al-Madboly et al. 2017;Nagpal et al. 2012).

L’effet prébiotique du gel de l’Aloe vera sur la croissance bactérienne et/ou l’activité acidifiante n’est pas régulièrement aperçu dans les résultats obtenus. Ceci pourrait être expliqué par l’utilisation de certaines bactéries lactiques l’acemanane et le glucomannane de l’Aloe vera. Ce métabolisme est à l’origine de lastimulation de la production de substances antimicrobiennes, telle que des acides organiques à courtes chaines, capables d’inhiber ces mêmes bactéries (Contreras-Pinzon et al.2007).Ce phénomène pourrait camoufler en partie le rôle prébiotique du gel de l’Aloe vera sur les bactéries lactiques.

La matrice de corrélation des paramètres étudiés (Tableau 4) est en accord avec les constations précédentes. En effet, les valeurs d’acidité et de pH, après 24 et 48h corrèlent significativement entre elles : R varie de 0,69 et 0,81. De plus, entre le pH et l’acidité, R est comprise entre -0,71 et -0,68. Par contre, les valeurs de dénombrement ne corrèlent ni avec le pH ni avec l’acidité, puisque les valeurs de R sont faibles (de -0,1 à 0,1).

L’analyse en composantes principales des données regroupées dans le Tableau 3 a permis de définir deux composantes principales (CP1 et CP2) qui expliquent 80,48% de la variabilité totale. Les coefficients de corrélations linéaires des paramètres analysés, par rapport aux composantes principales, sont calculés et rassemblés dans le Tableau 5. La dispersion de ces données sur la CP1 explique près de 51,76% de l’inertie totale. La CP1 montre une forte corrélation positive avec le pH à 24 et 48h, contre une corrélation négative avec l’acidité (24 ou 48h). Il est à noter que les coordonnées obtenues, pour 24 et 48h sont très proches. Par ailleurs, la CP2 présente une forte corrélation positive avec le nombre d’UFC, exprimé en log(UFC/ml) après 24 ou 48h.

La représentation graphique des coefficients des coordonnées des paramètres mesurées selon les deux composantes CP1 et CP2(Figure 2) permet de répartir les cultures de bactéries lactiques en trois groupes en montrant un effet significatif de la dose 100% d’Aloevera(d5), quelque soit le ferment.

Cette dispersion des cultures de bactéries lactiques permet de regrouper aussi(i) les souches en cultures pures, particulièrement L. fermentum ; et (ii) les cultures industriels mixtes M1 et M2, qui corrèlent positivement avec le nombre d’UFC/ml. Ces ferments sont composés par les deux espèces : Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus, utilisées dans l’industrie laitière pour la fabrication du yaourten agissant en synergie entre elles. L’examen de l’évolution du nombre de chacune des deux espèces (Tableau 6), permet de constater que les lactobacilles du ferment M1 sont plus sensibles à l’ajout de l’Aloevera, (Δlog UFC≈2), que celles du ferment M2, (Δlog UFC ≈1). Toutefois, il est connu que ces souches sont responsables de l’acidification du lait au cours de la fabrication des produits laitiers fermentés. En ce qui concerne Streptococcus thermophilus, sa croissance est réduite dans le cas de M1, contre une augmentation dans le cas de M2. Ces deux phénomènes sont progressifs avec l’augmentation de la concentration en gel. Les comportements différents des souches de M1 et M2 en présence du gel de l’Aloe vera pourrait être expliqué non seulement à l’effet de ce dernier, mais aussi à la synergie de ces deux espèces entre elles qui amélioreraient leurs résistances. Par conséquent, la souche probiotique, L. fermentum (S1) et le ferment mixte M2, sont les cultures de bactéries lactiques les plus adaptées pour une application industrielle en présence de 15% de gel.

4. Conclusion

Cette étude a montré que les extraits du gel ou de l’écorce de la feuille de l’Aloe barbadensis Miller possèdent des activités antimicrobiennes vis-à-vis des microorganismes d’altérations ou pathogènes. Les extraits éthanoliques ont le pouvoir le plus élevé, particulièrement vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Cette propriété de l’Aloe vera pourrait être exploitée dans les aliments pour améliorer leurs bioconservation. De plus, le gel de l’Aloe veraa amélioré l’activité et la croissance de certaines bactéries lactiques étudiées. Il s’agit du ferment mixte M2 et de la souche probiotique L. fermentum S1. Ainsi, un lait fermenté par ces deux cultures bactériennes et enrichi au gel de l’Aloe vera à 15%, pourrait êtreenvisagé. Ce dernier serait un aliment fonctionnel qui ferait bénéficier le consommateur non seulement des bienfaits de l’Aloe vera, mais aussiceux des bactéries lactiques, notamment probiotiques. 

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