Caractérisation moléculaire d’une collection autochtone de sulla du nord Hedysarum coronarium L. et estimation de la variabilité génétique par les marqueurs AFLP

F. BEN JEDDI ¹

M. JAMMAZI ¹  

¹ University of Carthage, Institut National Agronomique de Tunisie, Research Unit Vegetable and Flower, 43 Avenue Charles Nicolle 1082 Mahrajène city Tunis, Tunisia

Summary - 23 wild genotypes collected from different climatic regions of Tunisia and 6 Italian cultivars of Hedysarum coronarium L. (sulla), were identified and characterised by using the AFLP molecular marker. Electrophoresis profiles obtained indicated a very high percentage of polymorphism for all accessions exceeding 80 %. The statistical analysis of the data obtained show that genotypes could be partitioned on to three to four distinct groups. The local collection of sulla showed more than 50 % similarity index suggesting a greater useable genetic variability.

Keys words : AFLP / molecular marker / genotypes / sulla

Résumé - Dans ce travail 23 génotypes locaux d’Hedysarum coronarium L. (sulla du nord) collectées de diverses régions pédoclimatiques ont été caractérisés par le biais des marqueurs moléculaires AFLP en comparaison avec 6 cultivars d’origine italienne. L’analyse des profils électrophorétiques obtenus a montré un pourcentage de polymorphisme très élevé dépassant 80 %. Ainsi, les génotypes locaux peuvent être répartis en 3 à 4 groupes distincts. La collection locale de sulla se caractérise par un indice de similarité supérieur à 50 %. Ceci montre l’importance de la variabilité génétique des génotypes de sulla dans les programmes d’amélioration.

Mots clés : AFLP / marqueurs moléculaires / génotypes / sulla

1. Introduction

Le patrimoine génétique pasto-fourrager autochtone constitue une richesse d’une grande importance (Heyn, 1963; Abdelguerfi et al., 1996; Ben Jeddi et al., 1998 et Ben Jeddi, 2005). L’évaluation et la préservation de la diversité génétique des espèces sauvages sont fortement utiles pour la création variétale et l’amélioration des espèces entre autres Hedysarum coronarium L., comme plante fourragères et pastorale de grande valeur agronomique (Ben Jeddi, 2005). Des études sur la variabilité morphologique, bio-agronomique, iso-enzymatique, génétique et moléculaire ont intéressé l’espèce sulla (Baatout et al., 1985; Trifi et Marrakchi, 1999, Louati et al., 2000; Khriji et al., 2002 et Ben Jeddi, 2005). Ces travaux démontrent l’existence d’une importante variabilité génétique indépendamment de l’origine géographique.

Encore à l’état spontané, la diversité naturelle du sulla est soumise à l’érosion génétique amplifiée par l’action de l’homme (urbanisation..), les conditions éco-géographiques stressantes (surpâturage, sécheresse..) et l’introduction de variétés étrangères (Ben Jeddi, 2005). Ces facteurs érosifs engendrent une dégradation des ressources phyto-génétiques entraînant parfois la raréfaction voir la disparition de certaines espèces reliques cantonnées actuellement dans des zones limitées.

Cependant, les variétés commerciales présentes sur le marché local comme Grimaldi, Sgaravatti, Sparacia (Italie), Aigainon (Grèce), Aoukou et Necton (Nouvelle Zélande) ont souvent montré leur faible valeur adaptative aux conditions pluviométriques très aléatoires de la Tunisie (Ben Jeddi, 2005).

Le progrès de la biologie moléculaire pour l’analyse du génome a révélé que la variabilité génétique au niveau de l’ADN est plus importante par rapport aux produits géniques et que les marqueurs moléculaires de l’ADN produits sont très efficientes pour la caractérisation des variétés, lignées et clones dans différentes espèces (Cooke, 1995; Rao et al., 1997; Zhu et al., 1998 ; Ambrosino et al., 2002).

Le présent travail consiste alors à une caractérisation moléculaire par marqueurs AFLP pour révéler le polymorphisme intra-spécifique dans une collection d’Hedysarum coronarium L locale, classer les différents génotypes selon leurs distances génétiques, et essayer d’isoler des groupes différents intéressants pour des améliorations variétales ultérieures.

2. Matériels and Méthodes

2.1. Origine des génotypes

Le matériel génétique consiste à une collection de 29 génotypes d’Hedysarum coronarium L. dont 23 écotypes tunisiens (Ben Jeddi et al., 1998) et 6 cultivars d’origine italienne. Le tableau 1 présente la distribution géographique du matériel biologique utilisé.

2.2. Extraction de l’ADN

Les semences de chaque génotype ont été semées séparément dans des bacs de dimension 40x20 cm et mises en germination dans un germoir à température et luminosité contrôlées respectivement 25°C et 16 heures de photopériode durant 30 jours. Un intervalle d’arrosage de 48 heures a été respecté durant toute la période de germination. Au stade 3 feuilles unifoliolées, 5gr de feuilles ont été récoltées et surgelées à – 80°c dans l’azote liquide. L’extraction de l’ADN a été faite selon la méthode modifiée de Probesky, 1997. Pour obtenir 10 μg d’ADN, il faudra 1 gr de feuilles. L’ADN est quantifié sur la base d’une confrontation avec une concentration connue d’ADN purifié du phage λ. L’ADN isolé est par la suite conservé à –20°C.

2.3. Digestion de l’ADN et préparation de la réaction

Pour la digestion de l’ADN, on a utilisé la combinaison d’enzymes de restriction ECORI/MseI. 500 ng d’ADN génomique ont été digérés pendant une heure à 37°C en utilisant 5 u de MseI (Gibco) et 5 u de ECORI (Takara). Le tampon de digestion de 40 μl consiste à 10 mM tris Hac. à pH 7,5; 10 mM Mg ac.; 50 mM K ac.; 5 mM DTT et 50 ng/μl BSA. Pour la liaison 10μl d’une solution contenant 5 mmol de ECORI biotine adapter, 50 mmol de MseI adapter; 1u T4 DNA ligase; 1mM ATP dans 1 mM Tris-Hac. à pH 7,5; 10mM MgAc.; 50 mM Kac.; 5 mM DTT et 50 ng/μl BSA ont été ajoutées (Lin et Kuo, 1995). L’incubation a été effectuée à 37°C pendant 3 heures. Le produit de la réaction a été conservé à –20°C.

2.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

La réaction AFLP emploie généralement deux amorces d’oligonucléotides correspondant aux deux extrémités générées de deux enzymes ECORI et MseI (Vos et al., 1995). L’une des deux amorces est généralement liée à l’extrémité ECORI est marquée par le phosphore (γ³³) ATP et T₄ poly-nucléotide kinase. La réaction de marquage pour 100 PCR consiste à un mélange de 2 mM Tris HCl à pH 7,5; 10 mM MgCl₂; 5 mM DTT; 0,5 mM spermidine (3 HCl forming); 500 ng d’amorce; 100 μci (γ³³) et 10 u T4 poly-nucléotide- kinase. Pour l’amplification on a utilisé 30 ng d’amorce MseI; 5 μl d’ADN; 0,4 u taq- polymérase (Perkin Elmer); 10 mM Tris-HCl à pH 8,3; 1,5 mM MgCl₂; 50 mM KCl et 0,2 mM de 4 dNTP.

Les conditions du PCR dépendent de la nature de sélectivité de l’extension de l’amorce utilisée pour l’amplification (Zabeau et Vos, 1993). Les conditions pour une sélectivité d’un seul nucléotide consistent à 20 cycles de 30 secondes de dénaturation à 94°C, une minute d’annealing à 56°C et une minute d’extension à 72°C. Cette réaction est dite pré-amplification. Alors que l’amplification sélective correspond à une sélectivité  de trois nucléotides comportant 36 cycles de 30 secondes de dénaturation à 94°C, 30 secondes d’annealing à 65°C avec un gradient de 0,7°C pour les 12 premiers cycles et puis à 56°C pour les 23 cycles restants et enfin une minute d’extension à 72°C. Toutes les réactions d’amplification ont été faites dans un PE-9600 thermocycler (Perkin Elmer corp. Norwalk CT. USA). Le tableau 2 présente la liste des oligonucléotides et des amorces utilisées pour les réactions d’amplification.

2.5. Préparation des échantillons et électrophorèse

Au produit de l’amplification dilué 10 fois dans une solution de TE, on a ajouté un volume égal (20μl) de formamide dye (98% formamide, 10mM EDTA à pH 8 et quelques mg du bleu de bromo-phénol et de xylène cyanol).

Après 5 minutes, le mélange a été dénaturé à 94°C, puis rapidement refroidi dans la glace. 8μl de chaque échantillon seront analysés dans un gel dénaturant de poly-acrilamide à 5% / bis-acrylamide 19:1; 7,5 M urée; 50 mM Tris; 50 mM acide borique et 1 mM EDTA. Pour 100 ml de solution d’acrylamide on a ajouté 500 μl de APS à 10% et 50 μl de TEMED.

L’électrophorèse a été effectuée sur un gel de séquençage 38 x 50 (Biorad Laboratories, Inc. Hercules CAUSA). Le tampon utilisé consiste à une solution de 100 mM Tris; 100 mM acide borique et 2 mM EDTA. L’électrophorèse a été faite à un voltage constant de 1600 volts pour une période de 3 heures. Ensuite, le gel a été récupéré et séché sur un gel dryer (Biorad Laboratories Inc. Hercules CAUSA) à 80°C pour deux heures. Le gel a été exposé à une pellicule radio sensible (Kodak) pour 70 heures.

2.6. Analyse des données

Le polymorphisme a été détecté par la présence ou l’absence de bandes suite à une lecture des profils électrophorétiques obtenus.

Les données ont été analysées statistiquement par le programme informatique NTSYS-PC version 2 pour Windows (Rholf, 1992). Le degré d’information du marqueur a été déterminé par le PIC (Poly-morphic Information Content) est calculé pour le marqueur AFLP selon la formule de Powell et al., (1996).

PIC = 1 – Σ _i=1fi²

La fréquence de l’allèle i (fi) dans le total des génotypes estime le taux de discrimination pour un locus moléculaire en tenant compte non seulement du nombre d’allèles par locus mais aussi de leurs fréquences relatives dans la population étudiée (Lübberstedt et al., 2000).

L’indice du marqueur MI ou Marker index est déterminé pour balancer le taux de polymorphisme détecté (PIC). Il a été calculé selon la formule:

MI = PIC x β x α (Powell et al., 1996).

β est la proportion des bandes polymorphes et α est le nombre d’allèles par essai.

Les données obtenues par AFLP ont été enregistrées sous forme binaire (Absence: 0, présence: 1) sur une matrice rectangulaire. La similarité génétique (GS) entre deux génotypes i et j a été déterminée selon la formule de Nei et Li (1979):

GS_ij = 2 N_ij / (N_i+N_j)

N_ij : le nombre de bandes en commun entre les génotypes i et j; et

N_i et N_j: le nombre total des bandes pour les génotypes i et j.

GS_ij nous renseigne sur la proportion des bandes en commun entre deux génotypes et il varie de 0 (aucune bande commune) à 1 (profil identique pour deux lignes).

La matrice de similarité obtenue par la méthode AFLP a été convertie en une mesure de distance (d) par la formule d = 1-GS est servira à générer une classification hiérarchique (Cluster) par la méthode UPGMA (Unweighted Pair Group Method with arithmetic Average) (Sneath et al., 1973).

3. Résultats et Discussion

Le marqueur moléculaire utilisé dans ce travail AFLP est capable de déceler les différences existantes entre les génotypes étudiés. Un taux élevé de polymorphisme a caractérisé tous les profils électrophorétiques de la collection d’Hedysarum coronarium L. l’analyse des 5 combinaisons d’amorces utilisées (Tableau 3) a montré un total de 476 bandes dont 436 bandes polymorphes et 40 bandes monomorphes manifestant ainsi un pourcentage de bandes polymorphes égal à 91,59 %.

Cependant, le degré d’information du marqueur PIC est élevé grâce au taux de polymorphisme important trouvé pour tous les génotypes. Ce résultat est conforme à des travaux sur d’autres espèces  comme le blé (Bohn et al., 1999; Donini et al., 2000); l’orge (Russel et al., 1997); le maïs (Lübberstadt et al., 2000); et le soja (Powell et al., 1996).

La variabilité génétique intra-spécifique a été déterminée selon la lecture auto-radiographique des différents génotypes d’Hedysarum coronarium L. Cette lecture a révélé un numéro de bandes AFLP variable d’un minimum de 65 à un maximum de 112.

L’analyse du degré d’information du marqueur PIC pour les différents génotypes de la collection de Hedysarum coronarium L. a donné une valeur de 0,32. Ceci montre que la technique AFLP peut être utilisée avec fiabilité au sein de l’espèce. L’indice du marqueur MI est élevé de l’ordre de 27,7. Ceci montre l’efficacité de cette technique à explorer la totalité du génome par un nombre réduit d’amorces.

La matrice de similarité obtenue a montré que la similarité génétique varie significativement. En effet, pour la collection d’Hedysarum coronarium L., l’indice de similarité est compris entre 0,54 et 0,78. Afin de déterminer les relations existantes entre les génotypes, une classification hiérarchique (cluster) a été établie en se basant sur la matrice de similarité calculée à partir de la matrice binaire (figure 2).

Le dendrogramme obtenu met en évidence la différence entre les deux collections qui forment deux groupes différents. Toutefois, il faut signaler qu’il existe au moins 50 % de similarité génétique entre eux. La collection italienne se distingue facilement de la tunisienne; avec une distance génétique de l’ordre de 0,35. on note ainsi l’importance de l’origine géographique dans la diversité génétique.

Dans ces conditions, la sauvegarde du patrimoine génétique fourrager dans le but d’une amélioration génétique est encore possible à travers des collectes ciblées (Ben Jeddi, 2005). Plusieurs génotypes semblent être intéressants comme futurs géniteurs à utiliser dans un programme d’amélioration génétique comme S1L9, S2XS1, S4L1, S14L6 et S21L1.

4. Conclusion

Actuellement la diversité biologique fourragère autochtone se trouve menacée par une érosion génétique amplifiée par des stress abiotiques chroniques comme la sécheresse. La prospection et collecte de germoplasme à partir de diverses régions bioclimatiques permettent de mieux contrôler l’évolution des ressources phytogénétiques. Ce matériel biologique destiné à l’amélioration doit être bien caractérisé afin de mieux reconnaître son génome et de mieux orienter les programmes d’amélioration génétique.

Il a été montré que la technique AFLP est une méthode fiable pour l’étude de la diversité génétique au sein de l’espèce Hedysarum coronarium L. Cette méthode couplée à une bonne caractérisation morphologique peut constituer un puissant outil dans les programmes d’amélioration variétale (Ben Jeddi, 2005). La caractérisation moléculaire des génotypes de sulla local comparé à des témoins d’origine italienne a montré que le germoplasme autochtone se distingue facilement de l’italien avec une distance génétique de 0,35. Toute fois, avec un indice de similarité inter-génotypique supérieur à 50 % et un taux de polymorphisme élevé la création variétale devient une voie de promotion pour cette diversité génotypique dans l’espèce Hedysarum coronarium L.

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