Effet de la nature et de la stérilisation des supports sur la viabilité et l’activité symbiotique de Rhizobium sullae

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Volume 19, Article 9

[Volume 19, Article 9]

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S. Hammami Tounsi¹

S. Fitouri Dhane²*

Z. Hammami¹

K. Hamdi¹

A. Chaabouni¹

T. Bettaieb¹

F.Ben Jeddi¹

¹ Institut National Agronomique de Tunisie 43, avenue Charles Nicolle 1082 Tunis, Tunisie

² Ecole Supérieure d’Agriculture de Mateur, Tunisie

Abstract - This study focuses on evaluating the ability of two new supports to maintain the viability of a rhizobialstrain RSU9 as an alternative to peat (used as a control) in two production processes (sterile and non sterile).The first tested carrier is a compost productbased on two native species (Arundo donax L. and Medicagoarborea L.). The second is a mulch of Ficus nitida L..The physicochemicalcharacterization of supports show a similarity of the mineral composition of the twosubstrateswithpeat (Badenoch and Carex) used for the production of commercial rhizobiainoculants.The bacteriacounting test showedthat carrier sterilizationincrease the survival of rhizobia 100 times duringstorageat 4 ° C for 3 months to 1 year.Compost has providedbetterstoragewhatever the production technique (sterile or non-sterile). Under sterile conditions, compost has improved the survival of RSU9 compared to peatby 95% to 51% after 3 months and 1 year of storage. In non-sterile conditions, compost has alsoimproved the survival of RSU9 compared to peatby 26% and 20% respectivelyafter 3 months, and 1 year of storage.

Afteroneyearstorage, compost-basedcarrier gave the best results in symbiotic association withsulla. Compared to peat, compost improved nodulation and dry biomass of sulla of 18% and 35% in sterile condition, and than 16% and 19% in non-sterile conditions.

Keywords: Rhizobium, Organic carriers, Inoculants, Compost.

Résumé - Cette étude s’intéresse à l’évaluation de la capacité de deux nouveaux supports à maintenir la viabilité d’une soucherhizobiale RSU9, comme alternative à la tourbe (utilisée comme témoin) selon deux méthodes de production (stérile et non stérile). Le premier support testé est un compost produit à base de deux espèces autochtones (Arundo donax L. et Medicagoarborea L). Le second est un mulch de Ficus nitidaL.

La caractérisation physico-chimique des supports montre une similitude de la composition minérale des deux supports avec certaines tourbes (Badenoch et Carex) utilisées pour la production d’inocula commerciaux à base de rhizobium.

Le test de dénombrement des bactéries a montré que la stérilisation des substrats augmente la survie des rhizobia de 100 foispendant le stockage à 4°C de 3 mois à 1 année.

Le compost a assuré la meilleure conservation et ce quelque soit la technique de production (stérile ou non stérile). En conditions stériles,le compost a amélioré la survie de RSU9 par rapport à la tourbe de 95% à 51% respectivement après 3mois et 1 année de conservation. En conditions non stériles, le compost a aussi amélioréla survie de RSU9 par rapport à la tourbe de 26% et 20% respectivement après 3 mois, et 1 année de conservation.

Après une année de stockage, le support à base de compost a donné les meilleurs résultats en association symbiotique avec le sulla. Comparativement à la tourbe, le compost a amélioré la nodulation et la biomasse sèche aériennedu sulla de respectivement 18% et 35% en condition stériles et de 16% et 19 % en conditions non stériles.

Mots clés: Rhizobium, Support organique, Inoculum, Compost.

1. Introduction

L’inoculation des semences par des souches rhizobiales efficientes est une pratique ancienne considérée comme source d’engrais azotés respectueuse de l'environnement. Il a été estimé que 2000 tonnes d’inocula sont produits annuellement dans le monde. Cette quantité est considérée comme suffisante pour inoculer 20 millions d'hectares de fabacées (Rebah et al 2007). Les plus grands producteurs se trouvent aux Etats-Unis avec une production annuelle de 1000 tonnes (Singleton et al., 1997).Cependant, la commercialisation des inocula est limitée dans les régions de l'ouest de l'Asie et de l’Afrique du nord à cause de la non disponibilité de la technologie ou des supports appropriés. De plus, l'importation de ces produits des pays producteurs de biofertilisants est limitée en raison des charges élevées et des risques de détérioration souvent dues à l'exposition de l’inoculum à des températures élevées durant le transport et le dédouanement. Les inocula sont commercialisés sous plusieurs formes (Stephens et Rask, 2000) dont la plus répandue est poudre à base de tourbe. Cette dernière est un support universellement préféré (Smith, 1992; Roughley, 1970; Burton, 1967; Peterson et Loynachan, 1981) en raisondesa capacité de rétention en eau et sa richesse en éléments minéraux et matière organique (Kishore et al., 2005; Okon et Labandera-Gonzalez, 1994). Cependant, elle n’est pas toujours disponible (Strijitom et Deschot, 1976; Graham-Weiss et al, 1987; Tilak et Subba Rao, 1978; Corby, 1976). D’où l’intérêt, de trouver d’autres matériaux organiques ou inorganiques économiques pouvant maintenir une bonne survie et croissance des bactéries pendant au moins 3 mois. Dans ce contexte, le présent travail s’intéresse d’une part à la caractérisation de deux supports organiques et d’autre part à tester la survie et le pouvoir symbiotique d’une souche rhizobiale (Rhizobium sullaeRSU9) durant une année de conservation sur ces supports.

2. Matériel et méthodes

   1. Préparation des supports

Trois supports de nature organique ont été utilisés dans cet essai: le premier est une tourbe importée d’Allemagne (T) de marque Solinova, représentant le témoin; le second est un mulsh de Ficus nitida (M) ramassé de l’arboretum de l’INAT. Le troisième est un compost (C) à base de deux espèces végétales autochtones: Arundo donax L et Medicagoarborea L. Le compostage a été effectué selon une proportion 1/1 à travers l'andainage des matériaux broyés à la surface du sol pour favoriser l'augmentation de la température. Les résidus ont été maintenus à un niveau d'humidité entre 65 à 70% par arrosage périodique. Le retournement de l’andain a été effectué chaque fois que l’andain atteint un niveau de température supérieur à 50°C durant la phase active et une fois par mois pendant la phase de maturation. Le processus a duré environ quatre mois. Les différents supports ont été séchés puis broyés à l’aide d’un broyeur mécanique (Retsch) afin d’obtenir une poudre fine de 250 µm de diamètre.

2.2. Analyses physico-chimiques des supports 

La capacité de rétention de l’eau des divers supports a été déterminéeselon la méthode citée par Somasegran et Hoben (1985). Le dosage des éléments (P_as, K_e, Ca et Na) a été réalisé comme suit : Un gramme de chaque support a été calciné à 450°C dans un four à moufle pendant deux heures. Ensuite, 10 ml d’acide nitrique (1N) ont été ajoutés aux cendres et menés à la digestion (100°C) durant 10 min. Les mélanges ont été par la suite filtrés dans des fioles de 100 ml et conservés à 4°C. Ces filtrats ont servi à la détermination par spectrophotométrie à flamme, du phosphore assimilable(P_as), calcium(Ca), potassium (K) et sodium(Na) par la méthode décrite par Pauwels et al. (1992). Le dosage de l’azote total N a été réalisé par la méthode Kjeldahl (Jones 1991). Le pH dans l’eau a été réalisé selon la norme internationale ISO 10390 (1994). Enfin, la matière organique a été déterminée selon la norme NT.76.04 (1983) par calcination,dans un four à moufle à 525°C, de 10 g de chaque support pendant deux heures.

2. Production de la solution bactérienne

La bactérie utilisée dans cette étude correspond à Rhizobium sullae RSU9, qui est une souche rhizobiale spécifique à Sulla coronariumL. et préalablement sélectionnée pour ces performances symbiotiques (Fitouri et al. 2012). La suspension bactérienne a été préparée par introduction d’une colonie de la souche RSU9 dans un milieu YEM liquide stérile et sa mise en agitation à 150 tours/min et à 28°C dans des conditions d’obscurité. Après 48 h, d’agitation la turbidité de solution bactérienne a été mesurée par un spectrophotomètre (OPTIZEN) à une longueur d’onde de 540 nm. Une densité optique (DO) proche de 1 traduit une haute densité rhizobiale (environ 10⁹ bactéries/ml).

3. Préparation, inoculation et conservation des supports

Une quantité de 1800 g a été prélevée de chaque support pour la production des inocula. La moitié de cette quantité a été stérilisée par trois autoclavages successifs espacés de 24 heures, à une température de 121°C et une pression de 1 bar (Saint-Macary et Neyra 1989, Somasegran, 1985). La solution bactérienne de RSU9 fraichement préparée et à DO =1a été ajoutée aseptiquement aux différents supports à raison de 30 et 50% de leurcapacité de rétention en eau respectivement en conditions de production non stérile et stérile. Les supports inoculés ont été emballés dans des sachets plastiques de dimensions 6 x 12 cmet préalablement désinfectés à l’alcool. L’ensemble des sachets a été étiqueté indiquant le type de support, souche ainsi que la date d’ensachage. L’ensemble des inocula ont été incubés à 28°C pendant 6 jours et stockés par la suite au frigo à 4°C pendant 365 jours.

4. Dénombrement des rhizobia conservés dans les différents supports

La viabilité des rhizobia dans les divers supports et en conditions stériles et non stériles a été estimée par comptage du nombre de cellules rhizobiales viables de RSU9par gramme de support. Pour cela, une série de comptages a été réalisée : le jour de l’inoculation, et respectivement après 6, 17, 35, 45, 91, 149 et 356 jours de conservation. Un gramme de chaque support inoculé a été prélevé aseptiquement et dilué dans 9 ml d’une solution stérilisée de NaCl à 0,9 % (pH=6). Des dilutions en série (10^-1 à 10^-10) ont été effectuées dans la même solution.Pour chaque niveau de dilution,et après un mélange par vortex de 15 secondes, 100 µl de chaque suspension est étalée aseptiquement et en 3 exemplaires sur des boites de pétries contenant un milieu YMA additionné de rouge Congo stérile (Montagne et Beunard 1984). Enfin, ces dernières ont été incubées à l’obscurité et pendant 3 jours dans une étuve réglée à 28°C.

5. Evaluation de l’infectivité de Rhizobium sullae RSU9

L’évaluation du pouvoir infectif de RSU9 après une année (365 jours) de conservation dans les différents supports a été vérifiée en association avec Sulla coronariumL. variété Bikra 21. Les graines de sulla ont été désinfectées par imbibition à l’hypochlorite de sodium (1%) et à l’alcool (95°) respectivement pendant 8min et 15secondes.Ces dernières ont ensuite été rincées 8 fois à l’eau distillée stérile, puis immédiatement semées dans des gobelets de 33 cl de volume remplis de sable stérile età raison d’une graine par gobelet. Au moment du semis, chaque graine a reçu 0,5 g d’inoculum dilué dans 5 ml d’une solution stérile de NaClà0,9 %.Cinq répétitions ont été réalisées pour chaque type de support. Les plantes ont été maintenues à 75% de leur capacité au champ par un arrosage périodique avec de l’eau distillée stérile, alterné par une irrigation avec une solution nutritive dépourvue d’azote (Vadezet al.,1996). 30 jours après semis, les plantes ont été récoltées et séparées en parties aériennes et racinaires. Après plusieurs séries de rinçages, les nodules de chaque plante ont été détachés des racines, comptés et pesés. Enfin, les masses des matières sèches des parties aériennes racinaires ont été déterminées par pesée, après dessiccation à l’étuve à 70 °C pendant 72 h.

6. Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée par le logiciel SPSS (Statistical Package for the Social Sciences), version 16. Toutes les mesures ont été répétées trois fois. L’effet de la nature du support sur la viabilité des bactéries a été déterminé en utilisant unmodèle linéaire et par comparaison des moyennes (Test Duncan). L’ensemble des mesures réalisées dans l’essai d’infectivité du sulla, a fait l’objet d’une analyse de la variance (ANOVA) par comparaison des moyennes (Test Duncan).Chaque moyenne est affectée d’une lettre. Les moyennes suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes, au seuil de probabilité 5 %.

3. Résultats et discussion

   1. Caractérisation physico-chimique des différents supports

Les caractéristiques physico-chimiques des trois supports sont significativement distinctes (Tableau 1). La tourbe a la capacité de rétention en eau la plus intéressante (74%) suivie du mulch de ficus (56%) et du compost (54%). Cependant, ce dernier est le plus riche en matière organique (55,75 %) et en éléments minéraux. Le compost présente une très bonne source de matière organique, de carbone, d'azote, de phosphore ainsi que d’autres nutriments qui favorisent la croissance et la viabilité des rhizobia. Ce sont généralement les propriétés nécessaires d'un support approprié aux rhizobia (Smith 1992; Rebah et al. 2007). Dans le même contexte, Khavazi et al. (2007) ont rapporté que l’addition de matériaux riches en matière organique (bagasse de canne à sucre/résidus de malt) à la perlite a prolongé de six mois la durée de conservation de Bradyrhizobium tout en augmentant leur nombre de cellules. De plus, selon Rebah et al. (2007), la richesse d’un support en azote et en carbone favoriseraitla croissance des bactéries rhizobiales. Dans cette étude, le compost est le plus riche en ces éléments en raison de sa composition qui combine une fabacée riche en protéines (Medicagoarborea L.) à une poacée riche en carbone(Arundo donax L.).Le mulch de ficus et le compostsont 11 à 14 fois plus riches en calcium que la tourbe, ce qui pourrait être en faveur de la croissance bactérienne (Smith 1992). Concernant le pH,le compost est le plus basique alors que la tourbe (6,6) et le mulch (7,28) sont considérés comme optimaux à la croissance des rhizobia (Saint et MacaryNeyra 1989; Sunita et Kaushik, 2008). L’alcalinité du compost pourrait éventuellement gêner certaines bactéries acidophiles. Toutefois, la souche RSU9 utilisée dans cette étude est sélectionnée pour supporter un pH alcalin allant jusqu’à 9,5 (Fitouri 2011).

2. Effet de la stérilisation des supports sur la survie des bactéries rhizobiales

La cinétique de croissance et de survie de la souche Rhizobium sullae RSU9 dans différents supports stériles et non stériles est présentée dans la figure 1.Durant les 6 premiers jours qui suivent l’inoculation bactérienne des supports, un accroissement de 10² à 10³ bactéries/gramme de substrat a été noté pour l’ensemble des substrats et avec les deux techniques de conservations (stériles et non stériles). Cet accroissement correspond à la phase d’incubation des rhizobia en conditions optimales de température (28°C) (Temprano et al. 2002). Selon Albareda et al. (2008), cette période d’incubation est très utile et améliore la survie des bactéries rhizobiales sur les graines de soja car elle favorise leurs adaptations aux supports. Par contre, selon Kharvazi et al. (2007) cette phase de pré-conservation serait inutile pour la conservation de Bradyrhizobiumjaponicum sur l’ensemble des supports testés.En conditions stériles, après cette période d’incubation de 6 jours,un pallier représentant une moyenne de densité de 10¹¹bactéries/gramme de substrat a été maintenu durant les 91 jours (environ 3mois)qui suivent l’inoculation des supports. Par la suite, et après environ 5 mois (149 jours) et une année (365 jours) de conservation, la densité rhizobiale de RSU9 a respectivement chuté à 10⁹ et 10⁷ bactéries/gramme de substrat.Contrairement aux supports stériles, la densité de bactéries rhizobiales dans les supports non stériles a été en continuelle diminution (Figure 1, Tableau 2). Après une année de conservation. De pareils résultats sont attendus et confirment les observations de Roughley et Vincent (1967). Cette baisse serait en relation avec une prolifération d’autres microorganismes antagonistes aux rhizobia (Olsen et al. 1994; Paau 1991). En effet, un accroissement du nombre de contaminants qui absorbe le rouge Congo a été observé lors des comptages des bactéries rhizobiales sur boites (YAMA-RC).

Chaque point correspond à une moyenne de trois valeurs. Les barres verticales représentent l’écart type. TNS: tourbe non stérilisée, MNS: mulch de ficus non stérilisé, CNS: compost non stérilisé; TS: tourbe stérilisée, MS: mulch de ficus stérilisé, CS: compost stérilisé

3.3. Effet de la nature des supportssur la conservation et la survie des bactéries rhizobiales

La viabilité des rhizobia dans les trois supports a été comparable durant la période d’incubation. Par la suite et selon le substrat de conservation, une variabilité de la densité bactérienne est notée.

JAI: Jours après l’inoculation; T: tourbe; M: mulch de ficus; C: compost. Chaque valeur correspond à une moyenne de trois répétitions.

Le compost a assuré la meilleure conservation (tableau 2) et ce quelque soit la technique de production (stérile ou non stérile). Le compost stérile a permis de maintenir les meilleures densités bactériennes avec des améliorations de la densité par rapport à la tourbe stérile variable de 95% à 51% respectivement après 3mois et 1année de conservation. En conditions non stériles, le compost a aussi donné la meilleure densité bactérienne durant toute la période de conservation, avec des améliorations par rapport à la tourbe de 26%, 103% et 20%respectivement de après 3 mois, 5 mois et 1 année de conservation.

La conservation sur Mulsh de ficus est moins efficace que celle du compost. En effet, comparativement au Mulsh, le compost améliore la densité rhizobiale de 40% à 185% respectivement après 5 mois et 1 année de conservation en condition stériles, et de 26 % à 160 % en conditions non stériles.

La richesse des différents supports en matière organique et en éléments minéraux est en relation directe avec la survie des bactéries (Smith, 1992). En effet, des corrélations positives entre la richesse du support en azote et la survie d’Azospriliiumlipoferumont été rapportées par Saranya et al. (2011). D’un autre coté, Gaind et Gaur (1990) associent l’effet des basses températures (4-10°C) à la réduction dela division et des activités métaboliques des cellules bactériennes. Cette réduction de la consommation de nutriments favoriserait la conservation des bactéries.

3. Evaluation du potentiel symbiotique de RSU9 conservé dans les divers supports

Le pouvoir symbiotique des bactéries rhizobiales RSU9 a été testé sur Sulla coronariumL. après 1 année de conservation à 4°C sur les différents supports (Tableau 3).

T: tourbe; M: mulch de ficus; C: compost. Chaque valeur correspond à une moyenne de trois répétitions.

L’inoculation du sulla avec les différents supports a engendré des formations nodulaires contrairement aux témoins non inoculés. Ce résultat montre de que tous les substrats ont conservé le pouvoir infectif de RSU9 même en absence de stérilisation. Toute fois, l’efficience de la souche a varié selon la nature et la stérilisation du support. La stérilisation des supports a eu un effet bénéfique sur la conservation du pouvoir infectif et effectif de RSU9 avec les trois substrats. Cette pratique de stérilisation a permis de conserver un nombre optimum bactéries viables en moyenne 100 fois plus élevé avec les trois substrats. Ces bactéries ont assuré une nodulation effective avec un maximum de nombre de nodules (11nodules/plante), de poids nodulaire (0,028 mg/plante)et de croissance aérienne (0,148 g/plante) et racinaire (0,134g/plante) enregistré avec le Compost. La conservation sur ce substrat et meilleure que celle sur tourbe. En effet en conditions stériles et comparativement à la tourbe, le compost a amélioré le nombre et le poids nodulaire de respectivement 18 % et 40%. Ce gain en nodulation a généré des améliorations des masses sèches aérienne et racinaire de respectivement 34,4% et 30,1%. Même en conditions non stériles, la conservation sur compost donne les meilleurs résultats avec des améliorations par rapport à la tourbe du nombre et du poids nodulaire respectivement de 16 % et 50%. Ce gain en nodulation a généré des améliorations des masses sèches aérienne et racinaire respectivement de 18,7% et 18,6%.Paradoxalement, la conservation des bactéries surMulsh de Ficus donne les plus faibles nodulations et croissance aérienne et racinaire du sulla aussi bien en conditions stériles, que celles non stériles.Ces résultats sont probablement en relation avec la libération de certains produits toxiques contenu dans le mulsh pendant la période de stockage et qui auraient des effets négatifs sur la survie de RSU9. Dans ce sens, Albareda et al. (2008) ont indiqué que l’utilisation du compost de liègecomme support de conservation des rhizobia a été non toxique pour les souches testées. L’ensemble de ces résultats montre que la conservation des rhizobia pour une longue durée (plus de 5 mois) est possible et meilleure sur le compost comparativement à la tourbe et au Mulsh de Ficus.Ce effet est en relation avec la composition physico chimique du compost qui a permis la conservation aussi bien de la viabilité de la souche RSU9, mais aussi de ses potentiels symbiotiques et PGPR (Plant GrowthPromotingRhizobia) (Albareda et al. 2008). Les résultats confirment celles du comptage de la densité bactérienne dans les différents supports, ce qui justifie la possibilité de l’utilisation du compost comme alternative à la tourbe. Dans ce sens, Mouhamed et Abdel Moneim (2010) ont signalé l’intérêt de l’utilisation d’un compost de jacinthe d'eau comme support d’inoculum pour l’amélioration de la nodulation, la croissance et le rendement de la féverole (Vicia faba L.).Bien que la conservation sur compost soit optimale dans cet essai, il est possible d’améliorer la survie des bactéries dans ce types de support par ajout de certains additifs tel que le calcaire (Ferrera et Castro, 2005).

4. Conclusion

Quelque soit la durée de conservation, le compost à base de Arundo donax L et Medicagoarborea L. assure la meilleure survie pour la souche RSU9. Après une année de stockage, l’inoculation du sulla avec le compost comme support de conservation des rhizobia, a donné les meilleures nodulations (11 nodules /plante, en conditions stériles) et (7 nodules /plante, en conditions non stériles) générant une amélioration de la production de matière sèche par rapport à la tourbe de 35% et 19 % respectivement en conditions stériles et non stériles. L’ensemble de ces résultats montre le potentiel du compost à être utilisé comme substituant à la tourbe dans la production des inocula rhizobiaux.

Remerciements :

Nos vifs remerciements et reconnaissances s’adressent à tous les membres de l'association Abel Granier et ATAE (Association Tunisienne d’Agriculture Environnementale) et en particulier Mme May Granier, qui ont participé au financement et à la réalisation de ce travail.

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